형질전환 담배에 조직형 플라스미노겐 액티베이터와 관련변이 단백질들의 발현
Expression of Tissue-Type Plasminogen Activator and Its Derivative Proteins in Transgenic Tobacco Plants
김형미(농촌진흥청 국립농업과학원); 심준수(국립농업과학원); 이용(국립농업과학원); 박효경(국립농업과학원); 윤문섭(농촌진흥청); 임규희(국립농업과학원); 안기성(국립농업과학원); 김용환(농촌진흥청); 한범수(국립농업과학원)
21권 1호, 64~69쪽
초록
본 연구는 의약적으로 중요한 인체 혈관 내피세포 유래 t- PA 및 t-PA 파생 단백질들을 담배에서 생산하고자 수행되었 다. 우리는 이전 연구에서 t-PA 유전자가 식물체에서 효소 활 성을 갖는 형태로 발현됨을 증명하였고 (Hahn et al., 2009), 식물체에서 발현된 t-PA는 상업적으로 판매되는 t-PA와 시험 관 내의 인공 혈전 용해 활성이 동등함을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 담배 코돈 이용에 최적화된 합성 t-PA 유전자 를 사용하여 t-PA 발현양의 증대, 세포내 소기관에 표적에 따 른 발현양 증대 및 정제의 효율성 증대를 위하여 카르복실 말 단에 His6를 부가적으로 갖는 t-PA의 파생 단백질을 담배에서 발현 하도록 식물발현 벡터를 제작하여 담배 형질전환 및 형 질전환체의 특성을 규명하였다. 1. 식물체에서 전체 수용성 단백질의 평균 발현양은 담배잎 에서 0.0454 (t-PAER), 0.0494(t-PAHis6)와 0.0485(st-PA) μg/ TSP mg으로 측정되었다. 이중 합성된 유전자로 형질전환된 담 배에서 가장 높은 발현양 0.0978 μg/TSP mg을 관찰할 수 있 었으며, 발현된 재조합 t-PA 및 파생단백질들의 분자량은 상업 적으로 판매되는 t-PA와 유사한 68 kDa을 확인할 수 있었다. 2. 합성 t-PA 및 t-PA 파생 유전자들의 담배 genomic DNA 내의 삽입은 PCR법으로 t-PA 유전자 크기에 해당하는 1.6 kb 의 PCR 산물을 관찰하여 식물 제놈 내에 삽입되어 있음을 확 인하였다. 3. 형질전환 담배잎 추출물 내에 존재하는 t-PA 및 t-PA 파 생 단백질들 (t-PAER, t-PAHis6)은 동물세포 배양에 의해서 생 산된 재조합의 t-PA 단백질과 피브린 분해 활성이 동등하였다. 4. t-PA 및 그의 파생 단백질을 발현하는 식물체는 야생종 담배와 비교했을 때 성장과 종자 생성에 별 다른 차이를 보이 지 않았다.
Abstract
t-PA is a proteolytic enzyme found in blood and tissues. The major physiological function of t-PA is to generate plasmin that can dissolve blood clots in the blood vessel. To express recombinant t- PA derivative proteins (t-PAER and t-PAHis6) and t-PA protein encoded by synthetic t-PA gene in plants, the DNA fragments encoding the synthetic t-PA and t-PA derivative proteins were cloned into a plant binary plasmid that included the cauliflower mosaic virus 35S promoter, a tobacco etch virus (TEV) leader sequence, an N-terminal signal peptide of the alfala glucose-regulated endoplasmic recticular protein and a 35S terminator. The insertion of the synthetic t-PA, t-PAER and t-PAHis6 genes in genomic DNA of tobacco plants was confirmed by PCR. Western blot analysis of the transformed tobacco leaves revealed single bands of approximately 68-kDa recombinant t-PA and its derivative proteins. ELISA experiments demonstrated that the highest level of recombinant t-PA expression was 0.0978 μg/total soluble protein (mg) in tobacco plants. The amount of recombinant t-PA and its derivative proteins in transgenic plants was estimated to range from 0.0011 to 0.0098% of total soluble proteins. The fibrinolysis of recombinant t-PA and its derivative (t-PAER and t-PAHis6) proteins was confirmed by a fibrin plate assay. These studies demonstrated that plants could be employed as bioreactor systems for lower cost t-PA production and may aid basic study for the high production of humanized t-PA.
- 발행기관:
- 한국국제농업개발학회
- 분류:
- 농학